Izolace klonu
Obecně je klonování prováděno za účelem získání klonu jednoho konkrétního požadovaného genu nebo sekvence DNA. Dalším krokem po klonování je proto najít a izolovat tento klon mezi ostatními členy knihovny. Pokud knihovna zahrnuje celý genom organismu, bude někde v této knihovně požadovaný klon. Existuje několik způsobů, jak to najít, v závislosti na konkrétním příslušném genu. Jako sonda se nejčastěji používá klonovaný segment DNA, který vykazuje homologii s hledaným genem. Například, pokud byl myší gen již klonován, pak může být tento klon použit k nalezení ekvivalentního lidského klonu z lidské genomické knihovny. Bakteriální kolonie tvořící knihovnu se pěstují ve sbírce Petriho misek. Poté se na povrch každé desky položí porézní membrána a buňky k ní přilnou. Buňky jsou protrženy a DNA je rozdělena do jednotlivých řetězců - vše na membráně. Sonda je také rozdělena do jednotlivých řetězců a značena, často radioaktivním fosforem. Roztok radioaktivní sondy se potom použije k koupání membrány. Jednovláknová sonda DNA přilne pouze k DNA klonu, který obsahuje ekvivalentní gen. Membrána se vysuší a umístí proti listu záření citlivého filmu a někde na filmech se objeví černá skvrna oznamující přítomnost a umístění požadovaného klonu. Klon pak lze získat z původních Petriho misek.
genetika: Technologie rekombinantní DNA a polymerázová řetězová reakce
Technické pokroky hrály důležitou roli v postupu genetického porozumění. V roce 1970 američtí mikrobiologové Daniel Nathans
DNA sekvenování
Po klonování segmentu DNA lze stanovit jeho nukleotidovou sekvenci. Nukleotidová sekvence je nejzákladnější úrovní znalostí genu nebo genomu. Je to plán, který obsahuje pokyny pro budování organismu a bez získání této informace by nemohlo být úplné porozumění genetické funkci nebo vývoji.
Použití
Znalost sekvence segmentu DNA má mnoho použití a následují některé příklady. Za prvé, může být použit k nalezení genů, segmentů DNA, které kódují specifický protein nebo fenotyp. Pokud byla oblast DNA sekvenována, lze ji zkoumat na charakteristické znaky genů. Například otevřené čtecí rámce (ORF) - dlouhé sekvence, které začínají počátečním kodonem (tři sousední nukleotidy; sekvence kodonu diktuje produkci aminokyselin) a jsou nepřerušeny stop kodony (s výjimkou jednoho při jejich ukončení) - hledejte oblast kódující protein. Lidské geny také obecně sousedí s takzvanými CpG ostrovy - shluky cytosinu a guaninu, dvou nukleotidů, které tvoří DNA. Pokud je známo, že gen se známým fenotypem (jako je gen onemocnění u lidí) je v sekvenci chromozomální oblasti, stanou se kandidáty na tuto funkci nepřiřazené geny v oblasti. Za druhé, homologní sekvence DNA různých organismů mohou být porovnány, aby byly vykresleny evoluční vztahy uvnitř i mezi druhy. Za třetí, genová sekvence může být testována na funkční oblasti. Za účelem stanovení funkce genu lze identifikovat různé domény, které jsou společné pro proteiny podobné funkce. Například určité aminokyselinové sekvence v genu jsou vždy nalezeny v proteinech, které pokrývají buněčnou membránu; takové aminokyselinové úseky se nazývají transmembránové domény. Pokud je transmembránová doména nalezena v genu s neznámou funkcí, naznačuje to, že kódovaný protein je umístěn v buněčné membráně. Jiné domény charakterizují proteiny vázající DNA. K dispozici je několik veřejných databází sekvencí DNA, které mohou analyzovat jakékoli zúčastněné osoby.
